Our aim was to evaluate the reverse transcription and polymerase chain reaction (RT/PCR) technique for the detection of rotavirus shedding by infected children as a routine diagnostic procedure, in comparison to the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), electron microscopy (EM) and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) of rotavirus double-stranded RNA. Two-hundred and twenty stool specimens were collected from infants and young children with diarrhoea, and 10-20% faecal suspensions were made. Several methods of rotavirus dsRNA extraction were assayed. Electrophoretic analysis of viral RNA was carried out on 10% polyacrylamide gels followed by silver staining. RT/PCR was performed using oligonucleotide primers specific for both 3' and 5' ends of the rotavirus gene encoding VP7 which are highly conserved among group A rotaviruses. Following RNA extraction with phenol-chloroform and ethanol precipitation, RT/PCR could detect rotaviral RNA in only 11 of 25 samples known to contain rotaviruses by conventional methods. The purification of RNA extracts by CF11 cellulose and the application of the RNAID method were equally effective in extracting RNA and/or removing inhibitory substances from the faecal samples. RT/PCR led to the detection of 66 positive samples from 220 specimens tested (30%), whilst 64 specimens were positive by ELISA (29%), 59 (26.8%) by PAGE and 56 (25.4%) by EM. In our study, RT/PCR was 100 times more sensitive than the ELISA test in detecting rotaviruses serially diluted in a faecal suspension. Although RT/PCR is theoretically much more sensitive than ELISA, PAGE and EM for detection of rotaviruses, great care must be taken to remove inhibitory substances from the enzymatic reactions. We do not consider that RT/PCR should replace immunoassays with high sensitivity and specificity for rotavirus testing in faecal samples, although this technique has other applications, like the search for rotavirus in different clinical specimens (sera, cerebrospinal fluid, respiratory secretions, etc.) and in environmental samples, as well as the typing of viral strains using serotype-specific primers.
La RT/PCR a été évaluée pour la détection des rotavirus dans les selles des enfants ayant une infection due à ces virus. Les résultats ont été comparés à ceux de la technique ELISA, de la microscopic électronique (ME) et de l'électrophorèse de l'ARN viral bicaténaire en gel de polyacrylamide (PAGE). Nous avons préparé des suspensions fécales à 10-20% en Tris-NaCl-CaCl2 à partir de 220 échantillons provenant d'enfants souffrant de gastroentérite aiguë et utilisé différentes méthodes d'extraction de l'ARN viral. Dans la RT/PCR, des oligonucléotides spécifiques des extrémités 3′ et 5′ du gène codant la glycoprotéine VP7 ont été utilisés. La purification des extraits d'ARN avec la CF11 cellulose et le méthode “RNAID” ont été également efficaces pour l'obtention de l'ARN viral.
L'amplification par la RT/PCR a permis de détecter 66 échantillons positifs (30 %), pendant que 64 ont été positifs par l'ELISA (29%), 59 (26.8%) par l'électrophorèse de l'ARN viral et 56 (25.4%) par la ME.
La RT/PCR est plus sensible que l'ELISA, la PAGE et la ME pour la détection des rotavirus. Cependant il faut veiller à éliminer les possibles inhibiteurs des réactions enzymatiques. Malgré cette efficacité, nous considérons que la RT/PCR ne doit pas remplacer les techniques immunoenzy- matiques ayant une grande sensibilité et une haute spécificité pour la détection des rotavirus dans les selles. Mais cette technique est utilisable pour la recherche des rotavirus dans d'autres prélèvements (sérum, LCR, sécrétions respiratoires etc.) ou dans des échantillons provenant de l'environnement; elle peut, de plus, permettre de caractériser les sérotypes viraux.